使用MEGA11构建NJ树（Neighbor-Joining Tree，邻接树）

最近在完成生物信息学课程的作业，初次接触MEGA软件，故写一个笔记记录过程，可能比较潦草且有些无关内容，因为主要方便自己以后查阅，如有疏漏也欢迎大佬们指出，我会及时更正，本站About页有我的联系方式（建议发邮箱）。

作业内容是：“以10个TLR家族蛋白的TIR结构序列为例，使用mega11构建NJ树”。

1. 准备工作

目标序列可以先保存在一个文本文件中（一般为*.fasta文件，本文以此为例），文件内容就像下面这样

>sp|Q9BXR5|HUMAN_TLR10_TIR
CLHFDLPWYLRMLGQCTQTWHRVRKTTQEQLKRNVRFHAFISYSEHDSLWVKNELIPNLE
KEDGSILICLYESYFDPGKSISENIVSFIEKSYKSIFVLSPNFVQNEWCHYEFYFAHHNL
FHENSDHIILILLEPIPFYCIPTRYHKLKALLEKKAYLEWPKDRRKCGLFWANLRAAINV
NVLATREMYELQTFTELNEESRGSTISLMRTDCL
>sp|Q9NR96|HUMAN_TLR9_TIR
GWDLWYCFHLCLAWLPWRGRQSGRDEDALPYDAFVVFDKTQSAVADWVYNELRGQLEECR
GRWALRLCLEERDWLPGKTLFENLWASVYGSRKTLFVLAHTDRVSGLLRASFLLAQQRLL
EDRKDVVVLVILSPDGRRSRYVRLRQRLCRQSVLLWPHQPSGQRSFWAQLGMALTRDNHH
FYNRNFCQGPTAE

...

>sp|Q15399|HUMAN_TLR1_TIR
SYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEK
EGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHE
GSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLT
EQAKK

怎么下载mega11就不赘述了（官网）

因为要做进化树分析，所以请注意mega应为analyze模式，软件主界面右下角会有显示

analyze（分析）模式提供完整的gui，也是mega的默认模式，prototype（原型）模式则会禁用一部分可视化工具，适合cli使用，需要配合一个shell

2. 对齐序列

先在Alignment Explorer中打开目标序列的*.fasta文件

Align → Edit/Build Alignment → Retrieve a sequences from File

导入fasta文件后mega会自动选择数据类型（DNA或Protein），如果有误也可以手动选一下，这里做的是蛋白质序列，所以选Protein sequence

选中需要进行对齐的序列（这里Ctrl+A全选即可，不选也可以，后面会有弹窗询问是否选中全部）

Alignment选项里面提供了两种工具：ClustalW和Muscle

ClustalW是先做两两比对再计算两两距离矩阵，是一种经典方法，适用范围较广泛；Muscle则仅限于多序列比对，但速度会快很多。另外，如果是DNA序列建议选Codons方式。

更多区别就不赘述了，网上有很多文章介绍这个

这里我们选Align by Muscle，参数啥的默认即可

然后就可以导出已经完成对其的序列了，为了方便后续构建进化树，需要导出适用于mega的*.meg文件

Data → Export Alignment → MEGA Format

会有弹窗提示输入title of data，可以输入一段对该数据的描述（本文以“miku”为例），或者留空也行

如果我们用一个文本编辑器打开这个*.meg，会得到如下内容：

#mega
!Title miku;
!Format DataType=Protein indel=-;

#sp|Q9NYK1|HUMAN_TLR7_TIR
---HLYFWDVWYIYHFCKAKIKGYQRLI---SPDCCYDAFIVYDTKDPAVTEWVLAELVA
KLEDPRE-K-HFNLCLEERDWLPGQPVLENLS-QSIQLSKKTVFVMTDKYAKTE---NFK
IAFYLSHQRLMDEKVDVIILIFLEKPFQK----SKFLQLRKRLCGSSVLEWPTNPQAHPY
FWQCLKNALAT------------------DNHVAYSQVFKETV---

#sp|Q9Y2C9|HUMAN_TLR6_TIR
--YLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRNLQFHAFISYSEHDS---AWVKSELVP
YLEKED-----IQICLHERNFVPGKSIVENII-NCIEKSYKSIFVLSPNFVQSE---WCH
YELYFAHHNLFHEGSNNLILILLE-PIPQNSIPNKYHKLKALMTQRTYLQWPKEKSKRGL
FWANIRAAFNM----------------------KLTLVTENNDVKS

...

#sp|Q15399|HUMAN_TLR1_TIR
-SYLDLPWYLRMVCQWTQTRRRARNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDS---FWVKNELLP
NLEKEG-----MQICLHERNFVPGKSIVENII-TCIEKSYKSIFVLSPNFVQSE---WCH
YELYFAHHNLFHEGSNSLILILLE-PIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGL
FWANLRAAINI---------------KLTEQAKK------------

根据带#的标识符，可分为两类，分别是mega文件头部#mega和序列数据#sp

翻阅MEGA Format的规范可知：

Every data file must contain the key words #MEGA and TITLE.

The sequence data must consist of two or more sequences of equal length.

Frequently used symbols for identical sites, alignment gaps, and missing-information sites are ’.’, ’-’, and ’?’, respectively.

文件头部：对于上面这个例子，#mega标识符和!Title关键字是不可省略的（即使title内容为空），而!Format DataType关键字则可以省略（但再次导入mega软件时会弹窗要求选择序列格式）。

序列部分：meg格式的序列数据和fasta格式长得很像，但最重要的区别是meg格式要求一个文件中所有的序列数据的字符串都是等长的，而fasta格式则没有这种要求。对比之下，多出来的“-”字符（也允许使用“.”或“?”）就是用作对齐间隙的。所以，这也是为何在构建进化树之前要进行对齐序列操作。

3.构建进化树

回到mega主界面，Phylogeny菜单中有三种方法，分别是最大似然法（Maximum Likelihood）、邻接法（Neighbor-Joining）、最小进化法（Minimum-Evolution）

这里我们选择邻接法（NJ法）

可以直接把文件拖入工作界面，然后选择使用当前数据，也可以在文件选择视图中导入刚才导出的*.meg文件，怎么方便怎么来吧

设置构建参数：

Test of Phylogeny：Bootstrap method
No. of Bootstrap Replication: 1000（步长，一般选择1000~1500，本文以1000为例）
Number of Threads（使用的CPU线程数，保持默认或根据自己电脑性能调整）

其它保持默认即可

等待进度条跑完，然后就可以保存并导出结果了

可以在File选项中选择导出为Newick文件（*.nwk标准树文件），方便在下游可视化软件中导入，也可以在Image选项中选择保存为位图/矢量图或者pdf啥的，看具体需要

4.写在最后

可以参考MEGA的官方文档：MEGAX-Help（感觉还挺详细的，可惜没有中文，不过可以用“沉浸式翻译”之类的浏览器拓展来辅佐阅读）

笔者很懒，所以本文没放具体步骤的截图，不过后面可能会抽空补充一下，就这样